Magyar kutatók évek óta szeretnék megérteni, hogy milyen hatást gyakorolnak a tavainkban kimutatható fogamzásgátló hormonok a vízi élőlényekre és az ökoszisztémára. Ezt segíthet tisztázni Fodor István, a HUN-REN Balatoni Limnológiai Kutatóintézet Ökofiziológiai és Környezettoxikológiai Kutatócsoport tudományos munkatársának most induló kutatása egy gyakran alkalmazott modellállat, a nagy mocsáricsiga segítségével.

A három évig tartó, a kutató által tavaly elnyert posztdoktori OTKA pályázat keretében januárban induló vizsgálat arra a rejtélyre is választ adhat majd, hogy milyen módon befolyásolják a puhatestűeket ezek a molekulák, ha az ideg- és hormonális rendszerük együttesét alkotó neuroendokrin rendszerük működése – mint az elmúlt években kiderült – alapjaiban tér el a gerincesekétől, így az emberétől is.

A Balatonban már korábban kimutatott, emberi eredetű fogamzásgátló hormonok és más gyógyszermaradványok forrásai a szennyvíztisztító telepek, de a turizmus hatását is igazolta a kutatócsoport – mondta Fodor a Qubitnek. Az Ökofiziológiai és Környezettoxikológiai Kutatócsoport 2008 óta monitorozza folyamatosan a Balatonban és annak vízgyűjtő területén előforduló fogamzásgátló hormonokat és más szerves szennyeződéseket, mára összesen 134-et. Ezek közül általában 72-t meg is találnak – ezek időbeli és térbeli eloszlása a tóban attól függ, hogy mely hatóanyagról van szó, de többségüknél felfedezhető egy alapvető összefüggés a nyári turistaszezonnal. A szerek között előfordulnak antidepresszánsok, gyulladáscsökkentők, szív- és érrendszeri megbetegedéseket kezelő gyógyszerek, valamint rekreációs drogok is.

Ahogy arról tavaly írtunk, ugyanebben a kutatócsoportban Svigruha Réka és kollégái a tó mikroműanyag-szennyezettségével is foglalkoznak, amit a szakemberek 5 milliméternél kisebb szintetikus polimerek jelenléteként definiálnak. Bár a Balaton szennyezettsége nem nagyobb, mint más európai édesvízi tavaké, a kutató akkor a Qubitnek elmondta, hogy a nagy vízibolhán folytatott vizsgálatok alapján törekedni kell a tóba kerülő mikroműanyag mennyiségének minimalizálására, és tovább kell vizsgálni, hogy az anyagoknak milyen hatásai lehetnek a táplálékláncra.

De mi a helyzet a fogamzásgátlók hatásával? Mind az embriók, mind a kifejlett csigák esetében nagyon sok változást figyeltek meg, mondta Fodor, miután a nagy mocsáricsigát (Lymnaea stagnalis) a Balatonban előforduló koncentrációhoz hasonló (10 nanogramm/liter) mennyiségű fogamzásgátló hormonnal kezelték. A faj Észak-Amerikában, Eurázsiában és Óceánia egyes régióiban is előfordul, és a Balaton térségében elsősorban a tó vízgyűjtőjében található meg.

Elképesztően jól vizsgálható a csiga idegrendszere

A könnyen és jól vizsgálható idegrendszere miatt a nagy mocsáricsiga kedvelt modellállat a neurobiológiai és ökotoxikológiai kutatásokban, amivel a tihanyi intézet már közel három évtizede dolgozik. Ha a csigát egy Balatonból azonosított gyógyszerhatóanyagnak, például fogamzásgátló hormonoknak teszik ki kontrollált laboratóriumi körülmények között, és azt látják, hogy az állatok például többet táplálkoznak vagy mozognak, akkor könnyen meg lehet vizsgálni, hogy a módosult viselkedési mintázatnak mi az idegrendszeri háttere, és milyen sejt- vagy molekuláris szintű változások felelősek érte, mondta Fodor.

Miközben az embereknek 86 milliárd, az egereknek pedig 70 millió idegsejtjük van, a csigák mindössze 20-25 ezer idegsejttel rendelkeznek, és ezek is könnyen hozzáférhetők, viszonylag nagy méretűek és egyedileg azonosíthatók, ami különösen a múlt század fejletlenebb vizsgálati módszerei mellett volt nagy előny. Ezeknek köszönhetően az is jól behatárolható, hogy milyen neurális hálók alakítják ki az olyan különböző viselkedési mintázatokat, mint a táplálkozás, a légzés vagy akár a tanulás és az azt felidéző memóriafolyamatok.

A csigaembrióknál, amelyek fejlődése az átlátszó tojások miatt jól nyomon követhető, Fodor és kollégái azt tapasztalták, hogy a fogamzásgátlók hatóanyagát adó nemi szteroidok már a korai sejtosztódást is befolyásolták, sokkal lassabban keltek ki, valamint módosult az embrionális korban mutatott táplálkozási aktivitásuk, szívműködésük és mozgásuk is. A kutatók a kifejlett állatoknál a nemi szteroidok mozgásra és táplálkozásra gyakorolt hatásait vizsgálták, és azt találták, hogy az állatok aktivitása a koncentráció függvényében vagy nagyon megnőtt, vagy jelentősen lecsökkent.

De hogyan lehet ezt a csigával mérni? Fodor szerint a táplálkozási tesztnek az a lényege, hogy ezek az állatok nagyon szeretik az édes ízt, és ha cukoroldatot kapnak, az kiváltja bennük a táplálkozási magatartást. Ekkor reszelőnyelvükkel ritmikus mozgásokat végeznek (harapás), amit a kutatók meg tudnak figyelni. A hormonnal vagy más vegyülettel kezelt és a kontrollként használt csigákon ezután 2 percig figyelik a táplálkozási magatartást és számolják a harapások számát. Ez alapján meg lehet mondani, hogy az adott anyag befolyásolja-e a táplálkozási viselkedésüket, ami után el tudják kezdeni a hatás idegrendszeri hátterének tanulmányozását.

Fodor és kollégái kutatásaikhoz nem a hazai vizekből gyűjtött mocsáricsigákat használnak, mert nagy részük májmétely parazitával fertőzött, és emiatt életfolyamataik és viselkedésük eltér a normálistól, vagyis nem alkalmasak kontrollált kísérletek elvégzéséhez. Ehelyett az állatokat egy hollandiai tenyészetből szerzik be, és a Balatoni Limnológiai Intézetben mesterséges csigavízben, tiszta laboratóriumi körülmények között tartják életben.

Nem azért mutathatók ki a csigákban a nemi szteroidok, mert ők állítják elő őket

Fodor doktorandusz évei alatt a puhatestűekben vizsgálta a nemiszteroid-szintézis molekuláris útvonalait. A kutató először bioinformatikai módszerekkel feltárta, hogy az útvonalban két kulcsfontosságú lépés, a koleszterin és a tesztoszteron átalakítása a puhatestűekben nem található meg. Ennek az az oka, hogy a puhatestűek genomjaiból hiányoznak azoknak az enzimeknek a gerincesekével homológ, vagyis közös őstől eredő génjei, amelyek ezeket a lépéseket a gerinceseknél katalizálják – mondta a kutató.

Ezután azt is megerősítette, hogy ez valóban igaz a mocsáricsigára is, amihez a csiga genomja mellett az idegrendszeri transzkriptomát (vagyis az idegrendszeri sejtek által a génkifejeződés első lépése során DNS-ről átírt RNS összességét) is megszekvenálták. A biológusok így genetikai módszerekkel fel tudták térképezni, hogy a folyamatban résztvevő gerinces gének homológjai megtalálhatók-e a puhatestűekben.

A nemiszteroid-szintézis a szakember szerint egy nagyon komplex, többlépcsős folyamat, ami a lényegében minden állatban kimutatható koleszterinnel kezdődik. Ez a sejtek mitokondriumában elkezd átalakulni, majd a végén különböző nemi szteroidok lesznek belőle, mint a progeszteron, tesztoszteron vagy a szintézis lánc végén az ösztrogének, vagyis a női nemi hormonok, amelyek közé tartozik az ösztradiol is. A lánc bizonyos elemei a gének szintjén jelen vannak puhatestűekben is, és egyes lépéseket meg is tudnak csinálni, de közel sem annyira hatékonyan, mint a gerincesek – valószínűleg olyan enzimek révén, amiknek nem ez az elsődleges funkciójuk. Arra ugyanakkor nincs bizonyíték, hogy ezek a reakciók egy gerincesekéhez hasonló szteroidszintézis-útvonal részét képezik.

Mint Fodor elmondta, nem is olyan régen még azt gondolták, hogy a puhatestűek és a gerincesek neuroendokrin rendszere között lényegében semmilyen különbség nincs. A fő gerinces nemi szteroidokat, mint a tesztoszteron, progeszteron, és az ösztradiol, az 1920-30-as években fedezték fel. Puhatestűekben először 1955-ben mutatták ki őket, majd két évvel később kísérletek arra utaltak, hogy ezek hatással is vannak az állatokra. Ekkor még szerinte alig tudtunk valamit a gerincesek endokrin rendszeréről, a gerinctelenekéről pedig még annál is kevesebbet. „Ezért végül is ésszerű volt akkoriban az a feltételezés, hogy a kettő endokrin rendszer nagyon hasonló és szexszteroid-alapú” – mondta Fodor, ugyanakkor ez szerinte az évek során sok módszertanilag hibás vizsgálatot eredményezett.

A gerincesek endokrin rendszerének egyik alapját adó gonadotropinfelszabadító hormont (GnRH) 1971-ben fedezték fel, amiért hat évvel később Roger Guillemin, Andrew Schally és Rosalyn Yalow orvosi-élettani Nobel-díjat kaptak. Ezután polipokban leírták a gerinces GnRH gén egy feltételezett homológját, amit el is neveztek puhatestű GnRH-nak, ami tovább erősítette azt a feltételezést, hogy a puhatestűek és gerincesek endokrin rendszere azonos logikára épül. A hasonlóság egyik alapvető bizonyítékának sokáig azt is tekintették, hogy amikor a nemiszteroid-szintézisben résztvevő gerinces enzimek elleni antitestekkel vizsgálták a puhatestűek szöveteit, azok megfestődtek (immunhisztokémiai jelölés). Ehhez képest kiderült, hogy a pozitív jelet adó tesztet néha olyan fehérje (antigén) ellen végezték el, aminek a génje eleve hiányzik a puhatestűek genomjából, és csak jóval később, a gerincesekben alakult ki, egy másik evolúciós ágon.

Hogy hatnak a puhatestűekre a fogamzásgátló hormonok, ha látszólag nincsenek hozzá receptoraik?

Fodor szerint 2010-től kezdődően egyre több tanulmány kritikusan állt a puhatestű és gerinces rendszerek hasonlóságának koncepciójához, amiket a kutató doktori munkájának első éveiben saját kutatásaival is meg tudott erősíteni. Az egyik fő érv ezekben a szakcikkekben az volt, hogy az eredetileg puhatestű GnRH-nak elnevezett neuropeptid valójában más fehérjékkel van rokonságban, és a puhatestűeknél nagyon különböző, többnyire nem szaporodásban betöltött funkciói vannak.

Emellett arra is rámutattak, hogy nincsenek meg a puhatestűekben a nemiszteroid-szintézishez szükséges kulcsgének, valamint azok a nukleáris receptoroknak nevezett, sejtmagban és citoplazmában előforduló receptorok sem, amikhez ezek a molekulák a gerincesek sejtjeiben részben kapcsolódnak. A gerinceseknél a nemi szteroidokat ezeken kívül sejtmembránokban található membránreceptorok is észlelhetik, amelyek vizsgálata Fodor szerint ma felkapott terület, mert kulcsszerepet játszanak különböző daganatos, valamint neurodegeneratív megbetegedésekben.

A harmadik fontos elem az volt, hogy világos lett, a puhatestűek nagyon könnyen képesek felvenni a vízben található zsíroldékony nemi szteroidokat, és ezeket hetekig vagy hónapokig tudják raktározni, ami akár a vegyületek hatását is felerősítheti. A vegyületek felvételét és tárolását Fodor és kollégái saját, mocsáricsigán végzett laboratóriumi kísérletekkel is igazolták. Ezekben a kísérletekben radioaktív jelöléssel láttak el vízbe juttatott nemi szteroidokat, amiket aztán az állatokban még tíz nappal később is ki tudtak mutatni. A kutató szerint ha a Balatonból kiszedünk kagylókat és elvisszük őket a laboratóriumba, bennük is megtalálhatók lesznek ezek a nemi szteroidok. Ettől viszont még egyáltalán nem biztos, hogy azokat ők maguk állítják elő, és hogy eredetileg bármilyen szerepük lenne a szaporodásukban.

De ha nincsenek meg a puhatestűekben a nukleáris receptorok, hogyan hathatnak rájuk a vízben lévő hormonok? Korábbi kutatások arra utaltak, hogy olyan, úgynevezett gyors hatásokat kell keresni, amiket általában membránreceptorok közvetítenek. A 2010-es évek közepére megszületett a hipotézis – mondta Fodor –, hogy a gerinces nemi szteroidok hatásukat a membránreceptorokon fejthetik ki a puhatestűekben. Az ugyanakkor nem ismert, hogy a gerincesekhez hasonlóan a puhatestűekben is ténylegesen meg vannak-e az ehhez szükséges membránreceptorok, és a szakember az elnyert OTKA keretében ezt szeretné a csigák idegrendszerében vizsgálni.

Régi vitát dönthet el a kutatás

Fodor ehhez biokémiai, genetikai és idegsejtek aktivitását, valamint sejtszintű változásait feltáró elektrofiziológiás módszereket fog bevetni, amikkel kiderülhet, hogy valóban jelen vannak-e a csigában ezek a membránreceptorok, funkcionálisak-e, és milyen gyors sejtszintű változások figyelhetők meg az állatok idegrendszerében. Fodor tavaly már néhány membránreceptor-szekvenciát elkezdett vizsgálni, amikor Japánban dolgozott két hónapot egy ELKH mobilitási pályázat keretében és a Nemzeti Agykutatási Program támogatásával.

A kutatás Fodor szerint „mindenképpen el fogja dönteni azt a nagyon régi vitát, hogy ezek a membrán szexszteroid-receptorok megtalálhatók-e a gerinctelenekben is”. Ennek, mint mondta, van egy érdekes evolúciós aspektusa is, mivel a membránreceptorok alapvetően ősibbek, mint a nukleáris receptorok és funkcionálisan konzerváltak, vagyis hasonlók lehetnek különböző állatcsoportok között. Éppen ezért lehetséges, hogy már kialakultak a gerinctelenekben olyan membránreceptorok, amelyekhez képesek nemi szteroidok kötni.

A szakember szerint ha végül az jön ki, hogy még sincsenek a puhatestűekben a gerincesekéhez hasonló membránreceptorok, abból nem az következik, hogy ne tudnának hatni a nemi szteroidok ezekre az állatokra. Ezek olyan alternatív mechanizmusokon keresztül is kifejthetik befolyásukat, mint a más membránreceptorokhoz történő kötés, vagy magukon a sejten belül okozott változások.

Emellett az egyszerűbb idegrendszer vizsgálata segíthet megérteni olyan, membrán nemi szteroid receptorok által közvetített jelátviteli útvonalakat, amelyek működése még emlősökben sem tisztázott, és ez egyben azt is elárulhatja, hogy ezek evolúciósan mennyire ősiek. Emiatt a nagy mocsáricsiga nemcsak az ökoszisztémára gyakorolt hatásunkat segíthet jobban megérteni, hanem akár a saját szervezetünk működését is.