Laboratóriumuk automatizált polimeráz-láncreakciós (PCR) rendszere nélkül szinte lehetetlen lett volna több százezer mintát letesztelni a magyarországi szarvasmarha-állományt súlyosan veszélyeztető ragadós száj- és körömfájás vírusra – mondta Malik Péter, a Nemzeti Élelmiszerlánc-biztonsági Hivatal (Nébih) Állategészségügyi Diagnosztikai Laboratórium (ÁDI) Virológiai Osztályának vezetője szerdán a Magyar Zoonózis Társaság őszi tudományos ülésén.

A rendkívüli fertőzőképességgel bíró kórokozó idén márciusban 52 év után először jelent meg Magyarországon, és öt Győr-Moson-Sopron megyei szarvasmarha-telepen bukkant fel. A járványt viszonylag hamar sikerült megfékezni, és ennek eredményeként Magyarország szeptember 10-én visszakapta betegségtől mentes státuszát az Állategészségügyi Világszervezettől (WOAH), így helyreállhatott az állatokkal és termékeikkel folyó nemzetközi kereskedelem.

Ehhez a szakmai összefogás és drasztikus intézkedések, köztük közel 20 ezer állat leölése mellett elengedhetetlenek voltak a Nébih szakemberei által lefolytatott diagnosztikai vizsgálatok, amik lehetővé tették több ezer magyarországi állattelep monitorozását. A Qubit kérdésére Malik elmondta, hogy az automatizált diagnosztikai rendszer nélkül nem tudtak volna megfelelni annak a hatóságok felől nemcsak a ragadós száj- és körömfájás, hanem a madárinfluenza járványok esetén is fennálló elvárásnak, hogy a mintákat fél-egy nap alatt leteszteljék, és megállapítsák, jelen van-e bennük az adott kórokozó.

Jelenleg Malik és kollégái az ÁDI Virológiai laboratóriumban az új generációs szekvenálási (next generation sequencing, NGS) technológiát szeretnék meghonosítani, amit már Magyarországon is több helyen használnak kórokozók vizsgálatára: a Pécsi Tudományegyetemen, a Nemzeti Népegészségügyi és Gyógyszerészeti Központban, valamint a Korányi tüdőgondozóban. Az NGS szekvenálást az ÁDI Virológiai laboratórium nemcsak az állati vírusos fertőzések kimutatására tudná használni, hanem a kórokozók különböző változatainak és evolúciójuknak a nyomon követésére is.

Az ülés első fele ezekről, a vírusok kimutatását, terjedését, valamint evolúciójuk követését lehetővé tevő vírusdiagnosztikai módszerekről szólt. A tudományos társaság a területen felmutatott érdemeik miatt idén Malik mellett Takács Mária címzetes egyetemi tanárnak, az NNGYK Virológiai Laboratóriumi Osztály virológusának Hőgyes-Aujeszky Emlékérmeket adományozott. A szakmai elismerés az 1890-ben létrejött budapesti Pasteur Intézet megalapítójának, Hőgyes Endre orvos és egyetemi tanár, valamint a kutyák veszettség elleni oltását bevezető mikrobiológus, Aujeszky Aladár nevét viseli.

Előadásaikban a több évtizedes tapasztalattal rendelkező Malik és Takács nemcsak a kórokozókat kimutató módszerek történetéről, hanem csúcstechnológiás eljárásokról, valamint olyan innovatív jövőbeli lehetőségekről is beszéltek, mint a kórokozókat levegőből vagy vízből automatikusan kimutató rendszerek.

Az első járványok után még évezredeket kellett várni a kórokozók felismerésére

Az ókori civilizációk, ahol kulcsszerepe volt az állattenyésztésnek, rendszeresen küzdöttek állatok körében terjedő vagy állatokról átugró fertőzésekkel, mondta Malik. Ezeket azonban csak jellemző tüneteik alapján próbálták diagnosztizálni és kezelni. Később, a középkori Európában már egyre több betegséget ismertek fel az orvosok, és a pestis-, valamint a himlőjárványok megfékezésére már olyan, máig használatos járványtani intézkedésekkel próbálkoztak, mint a betegek egészséges emberektől történő elkülönítése.

Az első vakcinákra a 19. századig kellett várni, míg a vírusok betegségeket okozó ágensekként történő felismerésére csak a századfordulón került sor. A 20. században aztán az elektronmikroszkópok, a röntgendiffrakciós szerkezetvizsgálat és a molekuláris vizsgálati módszerek betekintést adtak a kutatóknak a vírusok addig rejtélyes világába. Ez lehetővé tette a vírusok változatosságának feltárása mellett annak megállapítását is, hogy miként okoznak fertőzéseket, ami elengedhetetlen a modern vakcinák és antivirális terápiák kifejlesztéséhez.

A vírusok kimutatására szolgáló első hatékony módszerek, mint az immunrendszerünk által a kórokozók ellen termelt antitesteket azonosító szerológiai vizsgálatok, az 1960-as és 1970-es években jelentek meg. Az először 1971-ben kifejlesztett, enzimhez kötött immunszorbens assay (ELISA) máig modern diagnosztikai módszernek számít, ami a vírus jelenlétét annak specifikus fehérjéihez kötődő antitestek segítségével mutatja ki, ami aztán egy enzimalapú, megfigyelhető színreakciót eredményez.

A robotizáció segíti a járványok elleni küzdelmet

A covidjárvány során közismertté vált PCR-alapú diagnosztizálás az 1980-as évek végén vált először széles körben elérhetővé, miután Kary Mullis amerikai biokémikus 1983-ban feltalálta a molekuláris biológiai vizsgálatokhoz használt módszert. A polimeráz-láncreakció során a DNS egy kívánt részét enzimek segítségével megsokszorozzák. A felamplifikált DNS-mintát ezután hagyományosan agargél-elektroforézissel lehet megjeleníteni, ahol az örökítőanyag darabkái elektromos áram hatására egyedi mintázatba rendeződnek, ami lehetővé teszi a kórokozó kimutatását.

Az RNS-vírusok esetén, mint a covidot okozó SARS-CoV-2, a madárinfluenzát okozó influenza vírusok vagy a ragadós száj- és körömfájást okozó FMDV vírus, az örökítőanyag felamplifikálása előtt egy köztes lépésre is szükség van, az RNS reverz-transzkripcióval komplementer DNS-sé történő átírására. Ezt a két lépést egyesíti a reverz-transzkripciós polimeráz-láncreakció (RT-PCR), ami összefonódott egy másik módszerrel, a valós idejű PCR-ral (real-time PCR vagy qPCR), ugyanis mindkettő az örökítőanyag felhalmozódó kópiáinak folyamatos, fluoreszencia segítségével történő megfigyelését alkalmazza. Ez nemcsak gyorsabban ad eredményt, mint egy hagyományos PCR, hanem lehetővé teszi a mintában jelenlévő víruskoncentráció meghatározását is.

Az 1990-es és 2000-es években, mondta Malik, megjelentek az első virológiai diagnosztikára szolgáló automatizált rendszerek, amik nagyban meggyorsítják a vírusdiagnosztikát. Bár a beérkező minták adatainak ellenőrzését és előkészítésüket még szakemberek végzik, a kezdeti lépés után már az automata rendszerek jönnek. Ezek elvégzik a mintából a nukleinsav-kivonást, majd a pipettázó robotok összekeverik az örökítőanyagot az úgynevezett PCR master mix-szel, ami a reakcióhoz szükséges előanyagokat és enzimeket tartalmazza. Végül ezt a keveréket kimérik a valós idejű PCR gépekbe kerülő csövekbe. Manuális pipettázással lényegében lehetetlen lenne napi több ezer mintát feldolgozni, mondta a kutató.

Az automata PCR rendszer után laboratóriumukban az NGS szekvenálást szeretnék meghonosítani, ami lehetővé teszi a fertőzést okozó vírustörzsek meghatározását is, és ez különösen fontos a madárinfluenza esetében. Malik ezt alátámasztandó felidézte Bálint Ádám állatorvosi virológus tavalyi, a Magyar Zoonózis Társaság rendezvényén tartott előadását, amiről a Qubiten is beszámoltunk. Ebben Bálint részletesen beszélt arról, hogy honnan érkeznek az Európába bejutó madárinfluenza-vírusok, és milyen törzsekből, milyen géncseréken (reasszortáció) keresztül hoznak létre új változatokat, amik megváltozott tulajdonságokkal bírhatnak.

Az NGS módszerekkel, mondta kérdésünkre Malik, ezek a kérdések sokkal gyorsabban és sokkal egyszerűbben megválaszolhatók. Több magyar labornak jó tapasztalatai vannak az egyik NGS technológiával, a nanopórus alapú szekvenálással, ami viszonylag egyszerű, és nincs nagy műszerigénye. A tenyérben elférő MinION szekvenálóról ismertté vált módszerrel, amit az Oxford Nanopore Technologies 2014-ben dobott piacra, a DNS-szekvenálási eljárásokat bemutató korábbi cikkünkben részletesen foglalkoztunk.

Az NGS-alapú vírusgenom-szekvenálással és a modern bioinformatikai módszerekkel nemcsak a vírusok változása követhető nyomon, hanem az idő előrehaladtával változó földrajzi elterjedésük is. Erre Takács Mária mutatott előadásában egy látványos példát egy még publikálás alatt álló kutatás alapján, ami a nyugat-nílusi vírus (West Nile virus, WNV) változatainak európai terjedését rekonstruálta. A virológus által lejátszott térképes vizualizáción látható volt, ahogy a madarak elterjesztik a kórokozót szerte Európában. Ehhez képest három évtizeddel ezelőtt még a néhány vírusváltozat evolúciós rokonságát ábrázoló filogenetikai fák felállítása is napokat vett igénybe az ország legnagyobb teljesítményű számítógépein. Ez Takács szerint jól illusztrálja, hogy az elmúlt évtizedek nemcsak a molekuláris technikák, hanem az informatikai módszerek térnyeréséről szóltak a virológiában.

Egy másik ígéretes módszer, aminek a meghonosításán dolgoznak, mondta Malik, az az NGS-el történő metagenom-szekvenálás, amivel egy mintatípusból (vagy környezeti mintából) többféle kórokozó is kimutatható. Ez lehetővé teszi, hogy a kutatók egy elhullott vadállat szájából vagy beléből vett mintákból ki tudják mutatni, milyen kórokozók találhatók benne, és lehet-e köztük olyan, aminek az állat elpusztulása szempontjából kóroktani jelentősége van. Ez segíthet a zoonótikus járványok korai észlelésében is.